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HE染色是病理學(xué)、組織學(xué)和胚胎學(xué)研究中常用的染色技術(shù)，今天，為大家?guī)碓敿?xì)的HE染色實(shí)驗(yàn)步驟及常見問題解析，助你輕松搞定HE染色！
一、HE染色原理
HE染色法通過堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅，分別使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色。蘇木精染液使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，而伊紅使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)呈紅色。這種染色方法能夠清晰地反映出組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞層次。
二、染色步驟
樣品制備
對貼壁生長細(xì)胞，使用胰蛋白酶來處理，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×10?/ml，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液滴加到放置在6孔板中的蓋玻片上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，細(xì)胞已經(jīng)附著并生長在蓋玻片上，此時(shí)將蓋玻片從6孔板中取出，用PBS 洗滌3次，去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基、血清、代謝廢物以及其他可能干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)。
樣品固定
使用95%乙醇固定20分鐘，用PBS洗滌2次，每次1分鐘。
染核
蘇木精染液染色2-3分鐘，自來水洗滌。
分色
顯微鏡下觀察，若細(xì)胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數(shù)秒，自來水洗滌。
染胞質(zhì)
浸入伊紅染液染色1分鐘，用自來水洗滌。
封片
吹干或自然晾干細(xì)胞爬片后，用中性樹膠封片。
三、漂亮的HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色，鈣鹽和細(xì)菌可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。
四、糟糕的HE染色常見問題
切片污染原因：蘇木精染液的氧化膜或伊紅染液的絮狀沉淀和其他試劑中的沉淀物所致；切片和貼片過程中，被其他病例的組織和細(xì)胞污染；取材時(shí)也可能造成污染。
解決方案：定期過濾染液和試劑；攤片時(shí)小心操作；恒溫貼片盆的水要常換或于每例貼片后用紙?jiān)谒婕皶r(shí)把殘余的蠟片拖走，以保證不污染。
細(xì)胞核染色蒼白暗淡原因：切片在蘇木精染色液停留時(shí)間過短；蘇木素染色液過度氧化，失去染色能力；鹽酸酒精的分化步驟處理時(shí)間過長。
解決方案：更換新的蘇木素，調(diào)節(jié)染色和分化時(shí)間。
染色不均勻，呈霧化狀態(tài)原因：常見于冬季室溫低時(shí)，二甲苯脫蠟不徹底，導(dǎo)致組織處理不當(dāng)。
解決方案：將二甲苯缸適當(dāng)加溫到30℃再脫蠟，或更換新的二甲苯。
切片在脫蠟后出現(xiàn)大片白色斑點(diǎn)原因：烤片溫度太低；脫蠟時(shí)間不足；二甲苯使用過久。
解決方案：確?？酒瑴囟群蜁r(shí)間足夠，更換新的二甲苯，進(jìn)行重新染色程序的染色。
細(xì)胞核染色過深，胞漿著藍(lán)色原因：蘇木素染色時(shí)間過長；切片太厚；分化時(shí)間太短。
解決方案：鏡下觀察切片厚度，重新染色或制片。
伊紅染色較淡原因：伊紅pH改變；藍(lán)化液殘留；切片太??；脫水時(shí)間過長。
解決方案：檢查伊紅染色液pH，調(diào)整實(shí)驗(yàn)步驟。
染色時(shí)切片脫落原因：組織脫水，透明不佳；石蠟未完全滲入，脫蠟時(shí)組織收縮，復(fù)水時(shí)組織又吸水膨脹，造成脫片；切片太厚、破碎、不整齊；染色前入水步驟不夠，組織吸水后快速膨脹，導(dǎo)致脫片。
解決方案：確保組織脫水、透明徹底，切片厚度適中，染色前入水步驟足夠。對發(fā)脆發(fā)硬的組織可用棉簽蘸5%氨水或2%冰醋酸溶液涂抹在組織表面10-15秒，然后精修出組織面，放入冰水混合物中泡1min，再切片。血栓、壞死或硬度較大的組織在染色時(shí)本身就極易脫落，應(yīng)小心操作。
染色模糊不清，灰染原因：組織未及時(shí)固定，部分自溶；固定不佳，深部組織未處理到；包埋時(shí)蠟的溫度過高、脫蠟不徹底、分化過度導(dǎo)致的顏色變淡等。
解決方案：重新固定組織，確保包埋和脫蠟步驟正確。
無法染色或淡染原因：組織固定時(shí)采用酸性甲醛、組織在甲醛中浸泡時(shí)間太長。
解決方案：使用新鮮的中性甲醛固定，或在存放的甲醛中加碳酸鈉中和甲酸。對于已經(jīng)制出的片子，染色前采用5%重鉻酸鉀溶液浸泡半小時(shí)以上，然后自來水漂洗5min，可改善染色。
出現(xiàn)類似小水珠物質(zhì)原因：脫水過程不徹底、中性樹膠封片前組織切片已經(jīng)干涸。
解決方案：用二甲苯徹底脫去封片膠，并重新封片。
出現(xiàn)色素沉淀物原因：切片染色后封固時(shí)，切片中的二甲苯已完全揮發(fā)或切片不經(jīng)過二甲苯透明，此時(shí)樹膠不能完全封固切片，而形成干燥的空氣氣泡或腔隙。樹膠封固劑過稀，封固當(dāng)時(shí)切片內(nèi)并不出現(xiàn)黑點(diǎn)，當(dāng)封固劑干燥或二甲苯揮發(fā)后切片內(nèi)可出現(xiàn)小黑點(diǎn)。樹膠濃度過高，流動不均勻，滴加的封固劑不能完全覆蓋切片。
解決方案：切片染色后，經(jīng)過苯酚-二甲苯混合液（1:3）處理或純二甲苯充分透明后再用樹膠。封固，可防止該色素顆粒產(chǎn)生。調(diào)整樹膠濃度，可濕封固。
HE染色雖然基礎(chǔ)，但每一步都至關(guān)重要。希望通過這篇詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟及常見問題解析，能夠幫助大家輕松搞定優(yōu)質(zhì)染色。
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